グラム染色で青藍色ないし青紫色に染まる細菌を指す。グラム陰性菌とグラム陽性菌との違いはそれらの細胞壁の構成成分の違いによる。細菌の細胞壁は細胞質膜の外側にある分厚く硬い層で、細菌特有の形を維持している。グラム陽性菌の細胞壁の構成は細胞質膜の多糖のムラミン酸というグリカン鎖とアミノ酸が結合したペプチド鎖とが連結した分厚い格子状のペプチドグリカン層があり、その下にタイコ酸と多糖層が重なっている。しかし、グラム陰性菌の細胞壁にあるような外膜をもたない。この外膜がないことから、クリスタル･バイオレットのような塩基性色素はペプチドグリカン層へ直接浸透するルゴール液のよう素と化合して、エタノール(エチルアルコール)に不溶性の物質に変化するので、グラム陰性菌(赤色ないし赤桃色)とは違った青藍色ないし青紫色に染色されるのである。
グラム陽性菌としてはブドウ球菌、連鎖球菌、ペプトコッカスなどの球菌のほかに、芽胞形成菌のボツリヌス菌、破傷風菌、ウェルシュ菌などのクロストリジウム属と炭疽菌、セレウス菌、枯草菌などのバチルス属、ジフテリア菌、結核菌、ノカルジア、乳酸桿菌、ビフィズス菌、放線菌などの細菌や真菌がある。